PCR là viết tắt của Polymerase Chain Reaction, là phản ứng được dùng để tạo ra lượng lớn các đoạn DNA hoặc RNA từ DNA khuôn ban đầu phục vụ cho các kỹ thuật liên quan đến DNA như: tinh sạch DNA, tổng hợp gen, giải trình tự gen...
PCR là viết tắt của Polymerase Chain Reaction, là phản ứng được dùng để tạo ra lượng lớn các đoạn DNA hoặc RNA từ DNA khuôn ban đầu phục vụ cho các kỹ thuật liên quan đến DNA như: tinh sạch DNA, tổng hợp gen, giải trình tự gen....
1. Nguyên tắc phương pháp PCR
Tạo ra số lượng lớn DNA từ DNA gốc ban đầu dựa trên sự hoạt động của enzym DNA polymerase để tổng hợp DNA theo nguyên tắc bổ sung giữa các base Nito là A-T, G-C.
2. Thành phần cần có của một phản ứng PCR:
- Khuôn DNA ban đầu.
- Đoạn mồi( đoạn olionucleotit): Mồi xuôi, mồi ngược.
- 4 loại nucleoit: dATP, dTTP, dGTP, dCTP.
- Đệm có chứa ion Mg.
- Nước siêu sạch.
- Enzym chịu nhiệt: Taq, pfu...
3. Các bước trải qua của phản ứng PCR:
Bước 1: Biến tính DNA, khi đó DNA của chúng ta đang ở mạch đôi sẽ tách mạch thành mạch đơn do sự tác động của nhiệt độ cao ( nhiệt độ biến tính thường 95oC).
Bước 2: Gắn mồi, Nhiệt độ lúc này sẽ hạ thấp xuống đúng với nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi bám vào DNA mạch đơn đã được tách mạch trước đó ( nhiệt độ thường từ 45- 60oC).
Bước 3: Kéo dài mạch, lúc này dưới sự tác động của enzym DNA polymerase mạch DNA sẽ được tổng hợp bổ sung ( thông thường nhiệt độ kéo dài dựa vào kích thước DNA và enzym).
4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả phản ứng PCR
- DNA khuôn: DNA được dùng để khuếch đại phải tinh sạch, và cần dùng một lượng rất nhỏ.
- Enzyme:Enzyme sử dụng phải là enzyme chịu nhiệt cao, nếu không enzyme sẽ mất hoạt tính và phản ứng PCR sẽ không xảy ra. Thường sử dụng Taq polymerase cho phản ứng PCR.
- Mồi và nhiệt độ bắt cặp mồi: Nếu mồi không đạt yêu cầu sẽ dẫn đến phản ứng PCR không đặc hiệu, tạo ra nhiều sản phẩm DNA không mong muốn. Để lựa chọn và thiết kế mồi ta dựa vào một số yêu cầu sau: Không có sự bắt cặp bổ sung giữa 2 mồi, nhiệt độ bắt cặp của mồi xuôi và mồi ngược không cách xa nhau quá, thành phần nucleotit giữa các mồi cân bằng giữa A - T -G -C, mồi phải đặc hiệu cho trình tự DNA cần khuếch đại.
- Nucleotit:Thông thường sẽ sử dụng 200M mỗi loại nucleotit, nồng độ cao hơn dễ tạo sản phẩm dương tính giả.
- Mg++: là coenzym cho enzyme polymerase, thông thường nồng độ tối ưu sẽ được xác định riêng cho từng phản ứng PCR.
- Số chu kỳ phản ứng: Thông thường không vượt quá 40 chu kỳ, thông thường từ 25-40 chu kỳ, tùy thuộc vào lượng tính toán các thành phân ban đầu ( nếu các thành phân ban đầu sử dụng trong 1 phản ứng hết mà chỉ đủ cho 25 chu kì mà ta chạy 40 chu kỳ thì sản phẩm DNA cũng không tăng lên, mà người làm thí nghiệm lại mất thời gian chờ đợi).
5. Thiết bị và dụng cụ:
- Máy ly tâm ống eppendorf: dùng để tách chiết DNA ban đầu, tạo ra sản phẩm DNA tinh khiết làm khuôn cho phản ứng PCR.
- Máy luân nhiệt PCR: Yêu cầu nhiệt độ giữa cá giếng phải chính xác, giúp ta có độ lặp lại giữa các thí nghiệm. Sự thay đổi nhiệt độ phải nhanh chóng.
- Ống eppendorf: là ống có vách mỏng, khả năng truyền nhiệt tốt.